5，回收。回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA。若本来DNA数量就不多，用手工法很容易丢失殆尽；如果DNA量很大可以考虑使用。
回收后要电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况，就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
6，感受态。做连接要求感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。都知道感受态效率高好，但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测，只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。所以如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要重做感受态了。制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做。用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
7，连接。最后才轮到连接。连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
②vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：9。如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于10％是很正常的。我做过一个长片断的连接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20个克隆有一个对。
③体系体积：通常用20ul都能连上，若连长片段可以压缩成10ul（前提是DNA数量不变）。我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都用50ul体系，照样百发百中。而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，体系中不加水也行。前述我自己连的长片段也是用20ul体系，vector和insert各上8ul。
④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。我用过Promega的，还好；BBI的凑合用。如果连长片段就加二倍的连接酶。
⑤连接时间：过夜。过夜就应该足够了，但是你要是不急着转化放到4度放几天也行，我个人认为时间长只好不坏。
⑥连接温度：最适是16℃。有人用PCR仪造16℃，我用泡沫冰盒加凉水再添冰，用手感觉差不多十四五六度，然后盖盖过夜，基本上温度不太变。你若感觉好不温度，拿个温度计测也行。有人用4度连接，也行，我有时先16度过夜，再放4度里几天。
⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要小心翼翼，尽量作到不放弃任何一个菌。一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。
⑧对照：对照很关键，可以反应出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：
⑴转化质粒对照。和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。还有一个作用，如果质粒早就长出来了，都长挺大了你的连接产物还没动静呢，那八成是没戏了，别等了赶快去准备下次连接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切系统吧。
⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。一、若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测“一”中所说的还检测是否有只进行了单酶切的。总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高，但也不能保证一次成功。在确保各步骤产物质量都不错的前提下若重复3、5次还没连上就要回头仔细检查这个克隆的策略有没有问题了，要是策略就有毛病你还懵然不觉那可就怎么做也做不出来了。
以上是本人的一点浅见，希望大家纠正补充。祝愿大家都能顺利完成连接。
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